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高滲乳酸鈉改善膿毒癥大鼠模型的微循環(huán)、心功能和炎癥

2023-05-13 20:27:25


高滲乳酸鈉改善膿毒癥大鼠模型的微循環(huán)、心功能和炎癥

摘要

(1)背景:

高滲乳酸鈉(HSL)可能在炎癥過(guò)程中起作用。我們旨在評(píng)估其在大鼠實(shí)驗(yàn)性膿毒癥(盲腸結(jié)扎穿刺(CLP))期間的作用。

(2)方法:

分三組(n=10/組):假手術(shù)組、CLP-NaCl 0.9%和CLP-HSL(CLP后2.5ml/kg/h液體18小時(shí))。評(píng)估腸系膜微循環(huán)、超聲心動(dòng)圖、細(xì)胞因子和生化參數(shù)。對(duì)毛細(xì)血管滲漏(Evans blue,n=5/組)和心臟血流動(dòng)力學(xué)(n=7/組)進(jìn)行了另外兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

(3)結(jié)果:

HSL改善了腸系膜微循環(huán)、心輸出量和左心室短縮分?jǐn)?shù)。HSL還提高了dP/dtmax斜率,降低了左室舒張末壓-容積關(guān)系,并減少了腸道、肺和肝臟中的伊文思藍(lán)擴(kuò)散。乳酸和3-羥基丁酸在CLP-HSL中較高。HSL患者的血漿細(xì)胞因子(IL-1β,TNFα,IL-10)以及血漿VEGF-A減少。

(4)結(jié)論

高滲乳酸鈉液可預(yù)防膿毒癥時(shí)的心功能不全、腸系膜微循環(huán)改變和毛細(xì)血管滲漏,同時(shí)減少炎癥并增強(qiáng)酮體。




Material and methods

前站、隨機(jī)、對(duì)照的研究設(shè)計(jì)及倫理


動(dòng)物程序

主要目的是比較HSL和0.9%NaCl對(duì)微循環(huán)的影響;先前的數(shù)據(jù)[21],我們預(yù)先計(jì)算了每組10只雄性Sprague-Dawley大鼠(400-500g)的數(shù)量,足以確定微循環(huán)流量差異20%,α風(fēng)險(xiǎn)為5%,效能為90%。次要目標(biāo)是心功能、毛細(xì)血管滲漏、炎癥和代謝。由于與微循環(huán)研究不兼容,其中一些目標(biāo)需要額外的動(dòng)物。根據(jù)我們之前的經(jīng)驗(yàn),Evans blue和壓力-容積回路分別為每組5只動(dòng)物和7只動(dòng)物。


實(shí)驗(yàn)流程

通過(guò)盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)誘導(dǎo)膿毒癥。通過(guò)腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪(75/5mg/kg)麻醉動(dòng)物。將3-F聚氨酯灌注導(dǎo)管插入右頸靜脈。結(jié)扎盲腸(占盲腸體積的75%)并刺穿盲腸(16克針頭)以使糞便外部化。在手術(shù)結(jié)束時(shí),將動(dòng)物隨機(jī)分為四組:接受11.2%乳酸鈉的CLP-HSL(1000 mmol/L鈉+1000 mmol/L乳酸鈉,法國(guó)APHP),接受0.9%NaCl的CLP-NaCl(154 mmol/L氯+154 mmmol/L鈉),接受8.4%碳酸氫鈉的CLP-HSB(1000 mmmol/L碳酸氫鈉+1000 mm/L鈉),假手術(shù)采用宮頸切開(kāi)術(shù)和剖腹術(shù),但不使用導(dǎo)管/CLP。不幸的是,HSB組6只大鼠中只有2只存活。出于道德原因,并根據(jù)為本研究提供的合法授權(quán),我們未完成本組研究。CLP大鼠無(wú)法獲得水和食物,并接受了18小時(shí)內(nèi)2.5毫升/千克/小時(shí)的研究液體輸注。向CLP-NaCl溶液中添加8%的叔丁基葡萄糖,以產(chǎn)生與CLP-HSL組相同的熱量[20]。實(shí)驗(yàn)中的大鼠被單獨(dú)關(guān)在籠子里。在使用氯胺酮/甲苯噻嗪(75/5 mg/kg)麻醉后,實(shí)現(xiàn)了三組不同的實(shí)驗(yàn):(1)超聲心動(dòng)圖和激光斑點(diǎn)成像(n=10/組),(2)伊文思藍(lán)測(cè)定(n=5/組),或(3)壓力-容積回路(n=7/組)。


(1)超聲心動(dòng)圖

在麻醉下實(shí)現(xiàn)超聲心動(dòng)圖,并使用M模式測(cè)量左室舒張末期和收縮末期直徑(LVEDD和LVESD),從而計(jì)算左室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)。脈沖波多普勒用于采集和計(jì)算二尖瓣E/A比。通過(guò)近端肺動(dòng)脈測(cè)量每克動(dòng)物的心輸出量。


(2)腸系膜灌注

超聲心動(dòng)圖檢查后,通過(guò)激光斑點(diǎn)對(duì)比成像對(duì)腸道進(jìn)行微循環(huán)采集。在遠(yuǎn)離空腸部位的四個(gè)相似感興趣區(qū)域?qū)崿F(xiàn)圖像分析,平均值表示為灌注單位(PU)。


(3)毛細(xì)血管滲漏和伊文思藍(lán)測(cè)定

靜脈注射伊文思藍(lán),45分鐘后用多聚甲醛將其從血流中沖洗掉。心臟(左心室)、肺、腸道和肝臟樣品在60°C下脫水5天,然后在37°C下在10%甲酰胺中孵育3天。使用分光光度法在620nm處測(cè)量離心上清液的吸光度。

在CLP-NaCl和CLP-HSL組中記錄液體平衡(尿量和輸注液體之間的差異)。


(4)血流動(dòng)力學(xué)

獲得左心室(LV)的壓力-容積環(huán)和血流動(dòng)力學(xué)。記錄/計(jì)算左室收縮壓(LVESP)、左室舒張壓(LVEDP)、dP/dtmin、dP/dtmax和左室舒張常數(shù)tau(Weiss法)。計(jì)算LVESP和LVEDP關(guān)系(LVESPVR和LVEDPVR),作為負(fù)荷無(wú)關(guān)的左室收縮功能和左室順應(yīng)性的指標(biāo)。在程序結(jié)束時(shí)采集血樣,使用冷凍滲透壓計(jì)測(cè)量和比較血漿滲透壓(mosmol/kg)。


(5)生物學(xué)參數(shù)

在手術(shù)結(jié)束時(shí),采集最大體積的血液。


(6)炎癥和毛細(xì)血管滲漏相關(guān)標(biāo)志物

IL-1β、TNFα和IL-10;使用ELISA測(cè)定血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A型(VEGF-A)和syndecan-1。


(7)生物化學(xué)

  在血液和尿液中測(cè)量尿素、鈉、鉀和氯化物。在血液中測(cè)量白蛋白。計(jì)算實(shí)驗(yàn)期間排出的離子的絕對(duì)量,計(jì)算整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間注入的離子量和排出的離子量之間的差異,并反映出在輸注期間體內(nèi)過(guò)量的離子


(8)新陳代謝

測(cè)定血糖、乳酸、丙酮酸、3-羥基丁酸和乙酰乙酸的血含量。


(9)統(tǒng)計(jì)分析

使用達(dá)戈斯蒂諾檢驗(yàn)評(píng)估數(shù)據(jù)分布,數(shù)據(jù)以四分位間距[IQ1–IQ3]或標(biāo)準(zhǔn)偏差(±SD)的均值表示。根據(jù)分布的正態(tài)性,使用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal Wallis或Mann-Whitney)或參數(shù)檢驗(yàn)(ANOVA或t-Student)實(shí)現(xiàn)組間比較,如果結(jié)果顯著,則使用Dunn或Holm-Sidak的多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行事后分析。實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)比較:CLP-NaCl組與假手術(shù)組和CLP-NaCl組與CLP-HSL組。因?yàn)槲覀冎荚谠u(píng)估HSL在膿毒癥期間的作用,所以sham和CLP-HSL之間的比較并不相關(guān),可能會(huì)降低分析的能力。所有比較均使用Prism v8.0(美國(guó)GraphPad)實(shí)現(xiàn)。p<0.05被認(rèn)為是顯著的。如果缺少關(guān)于每組實(shí)驗(yàn)次要終點(diǎn)的數(shù)據(jù),則應(yīng)用對(duì)照組的中值來(lái)支持無(wú)效假設(shè)。

 



結(jié)果

在每組22只大鼠中(3組實(shí)驗(yàn)),CLP-HSL組2只和CLP-NaCl組1只在灌注結(jié)束前死亡(補(bǔ)充新大鼠)。


(1)腸系膜灌注

與假手術(shù)組相比,CLP-NaCl組的腸系膜灌注平均值顯著降低(286±129對(duì)957±169 PU,p<0.0001)。相反,與氯化鈉相比,HSL顯著增強(qiáng)了CLP大鼠的灌注(712±366對(duì)286±129 PU,p=0.0006,圖1)。

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圖1. 激光散斑成像評(píng)價(jià)腸系膜微循環(huán)

(2)毛細(xì)血管滲漏

與假手術(shù)組相比,CLP-NaCL組的肺(300[253-452]vs.149[83-152],p=0.04),腸道(113[88-189]vs.35[21-41],p=O.009)和肝臟(70[50-89]vs.18[15-26],p=o.02)的伊文思藍(lán)擴(kuò)散增加(圖2)。心臟沒(méi)有觀察到差異。相反,在CLP大鼠中,與NaCl相比,HSL導(dǎo)致肺(94[78-136]vs.300[253-452],p=0.006)、腸道(37[31-43]vs.113[88-189],p=0.03)和肝臟(24[14-37]vs.70[50-89],p=0.04)的伊文思藍(lán)擴(kuò)散減少,但心臟沒(méi)有。同樣,HSL與NaCl相比顯著改善了流體平衡(? 1.5 [? 1.7至? 0.7]vs.2.0[1.6–2.2]mL/kg/h,p=0.002),HSL大鼠的尿量顯著較高(3.9[3.2–4.1]vs.0.3[0.3–0.8]mL/千克/h,p=0.008)(兩組的輸液量均為2.5 mL/kg/h,如“材料和方法”一節(jié)所述)。

1圖2. 在肺(a)、腸(b)、肝(b)和心臟(d)中使用伊文思藍(lán)測(cè)定法(n=5/組)檢測(cè)毛細(xì)血管滲漏。液體平衡結(jié)果(e)、尿量和輸注液體結(jié)果(f)

(3)超聲心動(dòng)圖

與假手術(shù)組相比,CLP-NaCl組的心臟輸出量減少(0.14[0.01-0.18]對(duì)0.30[0.26-0.34]mL/min/g,p=0.004),盡管左室短縮分?jǐn)?shù)沒(méi)有差異(39[33-52]對(duì)44[41-47]。關(guān)于我們模型中可用的前負(fù)荷靜態(tài)指標(biāo),CLP-NaCl組與假手術(shù)組相比LVEDD降低(6.2[5.2–7.3]vs.9.4[8.8–9.6]mm,p=0.001),但在E/A二尖瓣血流比方面沒(méi)有觀察到差異(1.3±0.4 vs.1.7±0.5,p=1.2)。

HSL vs.NaCl顯著改善了高心排血量(0.34[0.28–0.43]vs.0.14[0.01–0.18]mL/min/g,p<0.0001)和短縮分?jǐn)?shù)(55[46–73]vs.39[33–52]%,p=0.009)的CLP大鼠的左室收縮功能。未觀察到與預(yù)負(fù)荷靜態(tài)指數(shù)相關(guān)的差異。

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圖3 經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖

(4)LV pressure-volume loops

與假手術(shù)相比,CLP-NaCl組平均動(dòng)脈壓、舒張動(dòng)脈壓、系統(tǒng)動(dòng)脈壓和脈搏動(dòng)脈壓降低。壓力描記顯示,由于心室向力性降低,dP/dtmax和LVESP降低。然而,LVESPVR無(wú)差異,表明向力性的改變可能與心臟前負(fù)荷和/或后負(fù)荷的改變有關(guān)。相反,在CLP-NaCl大鼠中,dP/dtmin和LVEDPVR發(fā)生了改變,表明心室順應(yīng)性的改變,與心臟前負(fù)荷無(wú)關(guān)。與NaCl相比,給予HSL不會(huì)導(dǎo)致不同水平的動(dòng)脈血壓,但dP/dtmax更高,LVESPVR無(wú)差異,這表明向力性有所改善,但可能與前負(fù)荷增加有關(guān)。LVEDPVR的降低表明心室順應(yīng)性的改善依賴于心臟前負(fù)荷/后負(fù)荷。在本實(shí)驗(yàn)中,CLP-NaCl與假手術(shù)大鼠之間以及CLP-NaCl與CLP-HSL大鼠之間的血漿滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)沒(méi)有變化(表1)。

1:有創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和壓力-容積回路(n=7/組)

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(5)生物學(xué)參數(shù)

結(jié)果如表2所示。在CLP大鼠中,輸注HSL與血漿鈉濃度和尿鈉排泄顯著升高相關(guān),而血漿氯和鉀降低。ΔNa+,代表輸注期間體內(nèi)鈉的累積,在CLP-HSL和CLP-NaCl組之間沒(méi)有顯著差異。與假手術(shù)組相比,CLP-NaCl中的尿素含量是假手術(shù)組的兩倍,而HSL導(dǎo)致較低的血漿水平。與假手術(shù)組相比,CLP-NaCl組白蛋白減少,但與CLP-HSL組相比沒(méi)有。

關(guān)于代謝,CLP-NaCl組與假手術(shù)組相比,血糖降低了兩倍,血漿3-羥基丁酸減少。相反,與NaCl相比,HSL與較高的血糖、乳酸、丙酮酸和3-羥基丁酸的血漿水平相關(guān),但兩組之間乳酸/丙酮酸比率沒(méi)有差異。

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(6)炎癥

與假手術(shù)組相比,CLP-NaCl組炎癥反應(yīng)增強(qiáng),細(xì)胞因子IL-1β、TNFα和IL-10顯著升高(圖4,表2)。與NaCl相比,HSL降低了血漿中IL-1β、TNFα和IL-10的水平。

假手術(shù)組、CLP-NaCl組和CLP-HSL組之間的VEGF-A或syndecan-1無(wú)差異,但CLP-NaCl組與CLP-HSL組之間的VEGF-A水平降低。

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總結(jié):總之,在實(shí)驗(yàn)性膿毒癥模型中使用高滲乳酸液體可以改善微循環(huán)、毛細(xì)血管滲漏以及心臟和腎臟功能,可能通過(guò)代謝和炎癥途徑實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)和臨床研究都有必要深化HSL改善膿毒癥的機(jī)制,以及可能轉(zhuǎn)移到臨床膿毒癥的治療上。

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